Open Library - открытая библиотека учебной информации

Открытая библиотека для школьников и студентов. Лекции, конспекты и учебные материалы по всем научным направлениям.

Категории

Культура Характеристика клітин, що культивуються in vitro
просмотров - 338

Клітини того самого типу в тканині взаємодіють один з одним і погоджують швидкість розмноження, щоб підтримувати належну щільність популяції. «Соціальний» контроль такого роду чітко проявляється при реакціях на ушкодження. Наприклад, коли ушкоджений епітелій, клітини по краях рани стимулюються до поділу й наповзанню на оголену поверхню доти, поки вона знову не буде закрита; у цей момент швидка проліферація й рух клітин припиняються. Подібне явище можна спостерігати на дисоційованих клітинах у культурі. Епітеліальні клітини або фібробласти, поміщені в чашку, у присутності сироватки будуть «приклеюватися» до поверхні, розпластуватися й ділитися доти, поки не утвориться суцільний моношар, у якому сусідні клітини стикаються.

Адгезивні контакти забезпечуються утворенням комплексів з поверхневих рецепторів мембрани клітини. У результаті поперечного руху глікопротеїдів у мембрані утворюються елœектронощільні бляшки глікопротеїнових комплексів. Такі бляшки формуються у відповідь на вплив антитіл, аглютинуючих агентів (лектини) або сусідніх клітин. При адгезії субстрат діє як багатовалентне антитіло, а бляшки, які утворюються, називають «адгезивними плямами». Ці плями багаті «адгезивними білками» і завжди виділяють елœементи цитоскелœету, які містять глікопротеїди. Завдяки такій дії зменшується «розрідження» мембрани, і клітина захищається від округлення. Утворені на клітині адгезивні плями формують виступи, за допомогою яких і відбувається переміщення. Виступи цитоплазми (псевдоніжки, псевдоподії) при контакті із сусідньою мембраною гальмують рух. Клітини в цьому випадку направляють свої псевдоподії в іншому напрямку (феномен контактного гальмування). Коли культура стане моношаровою, активність псевдоніжок і рух клітин припиняється. Нормальні клітини перестають ділитися, це явище відомо як гальмування проліферації, залежить від густини клітин. Якщо такий моношар «поранити» голкою таким чином, щоб на чашці утворилася вільна від клітин смужка, клітини із країв цієї смужки починають просуватися на вільне місце й ділитися. Спочатку такі явища пояснювали тільки контактним гальмуванням клітинного ділення, але це, мабуть, не відбиває суті справи.

Густина клітинної популяції, при якій клітини в суцільному моношарі перестають ділитися, збільшується з підвищенням концентрації факторів росту в середовищі. Крім того, виявилося, що якщо культуральна рідина буде протікати по поверхні чашки з острівцями клітин, то клітини, що омиваються середовищем, яке щойно пройшло над іншими клітинами, будуть ділитися повільніше, ніж ті, які омиваються середовищем, що пройшло над вільними від клітин ділянками. У середовищі, що протікало над клітинами, не вистачає якихось важливих поживних речовин або факторів росту.

Фактор росту зазвичай присутній у середовищі в концентрації близько 10-10 М (приблизно одна молекула в об’ємі сфери діаметром 3 мкм). Один фібробласт має близько 105 рецепторів фактора росту, кожний з яких має дуже високу спорідненість до нього. Таким чином, у кожної клітини досить рецепторів, щоб зв’язати всі молекули ростових факторів в об’ємі сфери діаметром близько 150 мкм.

Крім того, вважають, що значна частина фактора росту, зв’язаного рецепторами клітинної поверхні, швидко поглинається шляхом ендоцитозу й руйнується. Із цього ясно, що сусідні клітини конкурують між собою за найменші кількості факторів росту. Такого роду конкуренція важлива як для клітин у тканині, так і для культивованих клітин, вона запобігає росту популяції вище деякого рівня її густини.

Конкуренція за фактори росту й поживні речовини не єдиний фактор, що впливає на швидкість поділу в клітинній культурі. Форма клітин під час їх розшарування й руху по поверхні субстрату на вільні місця теж сильно впливає на їхню здатність ділитися. При культивуванні нормальних клітин у суспензії, коли вони не прикріплені до твердої поверхні й тому мають округлу форму, вони майже ніколи не діляться (залежність поділу від прикріплення). Вплив розшарування клітин на проліферацію можна продемонструвати при вирощуванні клітин на субстратах з різною адгезивністю поверхні або на таких субстратах, де є лише маленькі адгезивні ділянки, на яких клітина може прикріпитися, але не може розшаруватися. Частота поділу клітин зростає зі збільшенням ступеня їх розшарування. Мабуть дуже розшаровані клітини можуть уловлювати більше молекул фактора росту й поглинати більше поживних речовин завдяки своїй більшій поверхні.

Однак деякі типи клітин, майже не здатні до проліферації в суспензії, активно діляться, як тільки їм вдається вступити в контакт із ділянкою субстрату, навіть якщо ця ділянка настільки мала, що клітина не може на ньому розшаруватися. Такі «фокальні» контакти є місцями з’єднання (хоча й непрямого) внутрішньоклітинних актинових філаментів з молекулами позаклітинного матрикса. Ці й інші спостереження наводять на думку, що контроль клітинного ділення якимось чином пов’язаний з організацією цитоскелœету. Хоча механізм і функції цього зв’язку не з’ясовані, можна вважати, що залежність поділу клітин від їхнього прикріплення, ймовірно, дозволяє тканині зберігати цілісність і запобігає проліферації клітин, що відокремилися від нормального оточення. Цикл прикріплення й відкріплення, ймовірно, дозволяє перегрупувати адгезивні контакти як між клітинами, так і між клітинами й матриксом, щоб вмонтувати тільки що утворені дочірні клітини в тканину, перед тим як вони зможуть почати наступний цикл ділення. Ослаблення контактів, мабуть, є важливою особливістю проліферативної поведінки більшості типів клітин. Наприклад, у ранній стадії реакції фібробластів на ростовий фактор відзначається руйнування їхніх фокальних контактів. Втрата керованості росту в ракових клітин майже завжди пов’язана з необоротним зменшенням клітинної адгезивності, що проявляється також у втраті фокальних контактів при вирощуванні таких клітин у культурі.

Зміна ростових властивостей культивованих клітин називається трансформацією. Трансформація – процес необоротний й, мабуть, включає генетичні зміни в тій специфічній частині спадкової інформації, що контролює неопластичний фенотип, що додається до трансформованого геному хазяїна. Зміна ростових властивостей є однією з адаптивних особливостей, що дозволяє клітинам проліферувати в умовах, несприятливих для нетрансформованих клітин. У такий спосіб в умовах, які обмежують ріст нормальних клітин, трансформовані клітини будуть рости до більш високої густини популяції, що, очевидно, буде пов’язано з їхньою зниженою потребою у факторах росту. Існують докази, що основна зміна при трансформації пов’язана зі зміною транспорту поживних речовин через клітинну мембрану, а це, у свою чергу, може зробити клітини менш залежними від «геометричних» факторів росту.

Трансформовані клітини здатні рости в умовах, у яких геометричні характеристики, а саме відношення площі поверхні до об’єму менш сприятливі. Отже, трансформовані клітини будуть рости в суспензійних культурах, утворюючи сферичні клони. Так, трансформовані клітини, будучи введеними імунологічно толерантній тварині у відносно невеликих кількостях, можуть утворювати пухлини. Із цієї причини трансформація іноді прирівнюється до злоякісних змін. Трансформація може бути або вірусною, або «спонтанною». Більшість досліджень проведені з клітинами, що піддавалися вірусній трансформації. Коли при цьому використовували добре відомі трансформуючі віруси, такі, як віруси SV40 і поліоми, то властивості трансформованих клітин проявлялися дуже наочно й були описані докладно. Аналогічні зміни, що спостерігалися після спонтанної трансформації, привели до припущення, що така трансформація є результатом активації послідовностей генів (онкогенів), що вже були присутніми у геномі трансформованої до цього клітини, подібної з такими у вірусному геномі. Багато досліджень підтвердили, що спонтанно трансформовані клітини мають таку ж послідовність основ у ДНК, як і в клітинах, трансформованих вірусами. Але в одній з робіт було показано, що аналогічні (нерозрізнені) зміни викликаються також крапковими мутаціями в нормальних генах. Старіння характерне для клітин, що мають обмежений потенціал проліферації, тобто низьку густину насичення при ідеальних умовах культивування. Прикладом можуть служити лінії диплоїдних клітин людини. Підвищена здатність до росту трансформованих клітин означає, що трансформація переважає над процесом старіння.

Старіння, безумовно, залежить від генетичних факторів, тому що кожен вид має характерну тривалість життя, але варіабельність усередині популяцій за цим показником свідчить також про вплив фенотипу. При адаптуванні диплоїдних клітин людини (лінія WI38) уже із самого початку було показано, що культивовані клітини можуть проявляти феномен старіння й мають обмежений час життя (50±10 подвоєнь популяції). Залежні від віку зміни, які при цьому спостерігалися, включали подовження міжмітотичних інтервалів (19±25% – 31±41%/годину), зміна метаболізму, рівнів ферментів й експресії продукту. Слід зазначити, що не встановлено чіткого зв’язку між тривалістю життя залежно від походження клітини (миша, людина) і потенціалом подвоєння їхніх клітин у культурі.

Обмежені за тривалістю життя клітинні лінії, наприклад лінії диплоїдних клітин фібробластів, не є ідеальними об’єктами для цілей виробництва, оскільки їх повинні використати до того, як у клітинах відбудуться серйозні зміни старіння. У практичних відносинах це означає, що період життя цих клітин, коли їх можна застосовувати з метою виробництва, становить між 12 й 30 пасажами (у першому випадку – для приготування посівного матеріалу). Трансформовані клітини не мають обмеженої тривалості життя, і це обумовлює таку їхню перевагу в біотехнології, як використання в якості субстрату для генерації різних продуктів у поєднанні з більш високою густиною популяції клітин, більш високими швидкостями росту й здатністю рости в суспензіях.


Читайте также


  • - Методы in vitro.

    Партеногенез in vitro – включает получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом (геномов) родителей утрачивается один из геномов. Ядра не сливаются в гибридной клетке, одно из ядер распадается. Яйцеклетка делится с образованием... [читать подробенее]


  • - МЕТОДЫ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ

    1. Вспомогательные методы in vitro в селекции растений. К вспомогательным методам относят1) искусственное оплодотворение в условиях in vitro(преодоление прогамной несовместимости); 2)преодоление постгамной несовместимости; 3)методы клонального размножения растений; 4) методы... [читать подробенее]


  • - In vitro с использованием клеточных культур

    Проведение тестирования безопасности наноматериалов 4.8.1. Подготовка клеточных культур и образцов наноматериалов к тестированию и внесение образца наноматериала в культуру 4.8.1.1. Исследования безопасности наноматериалов in vitro проводятся как на первичных, так... [читать подробенее]


  • - Запліднення in vitro

    До середини 70-х років ХХ століття склалися усі передумови для практичної реалізації ідеї лікування безплідності методом ЗІВ: розуміння ендокринних механізмів регуляції репродуктивного циклу, процесів дозрівання яйцеклітини та імплантації ембріонів, механізмів впливу... [читать подробенее]


  • - Методы генетического конструирования in vitro

    Включают работу с рекомбинантной ДНК. Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro, т.е. в «пробирке» с последующим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку. Т.к. с химической точки зрения ДНК всех организмов... [читать подробенее]


  • - Характеристика клітин, що культивуються in vitro

    Клітини того самого типу в тканині взаємодіють один з одним і погоджують швидкість розмноження, щоб підтримувати належну щільність популяції. «Соціальний» контроль такого роду чітко проявляється при реакціях на ушкодження. Наприклад, коли ушкоджений епітелій, клітини... [читать подробенее]


  • - Фактори, що впливають на морфогенез in vitro

    Індукуючий вплив можуть надавати різні фактори: гормони, продукти життєдіяльності сусідніх клітин, інших тканин, електрофізіологічні сигнали і т.д. Детермінація – придбання клітиною стану готовності до реалізації визначених спадкових властивостей. Детермінація... [читать подробенее]


  • - Выращивание ЭСК in vitro

    Для исследователей ЭСК - это пособие для расшифровки работы генома (особенно в период раннего эмбриогенеза и органогенеза). Необходимо напомнить, что изучение эмбриогенеза человека ограничено по биоэтическим соображениям. Постимплантационный эмбриогенез млекопитающих... [читать подробенее]


  • - In vitro

    Показаниям, после определения чувствительности Вялотекущем процессе Постельный режим ЛЕЧЕНИЕ ОСТРОГО РЕВМАТИЗМА ЛЕЧЕНИЕ Главная задача лечения после установления диагноза ревматической лихорадки /острого ревматизма/ - вылечить воспалительный... [читать подробенее]


  • - Методи радіонуклідної діагностикиполіляють на 2 групи: дослідження в цілому організмі (in vivo) і в біологічних середовищах|середі| (in vitro).

    Прилади для радіонуклідних досліджень Клінічні радіодіагностичні дослідження выполняютисполняют з помощьюпосредством спеціальних приладів. По медико-функціональному призначенню виділяють 3 групи радіодіагностичних приладів. I. Радіометри для вимірювання|виміру|... [читать подробенее]