Категории
Биотехнологии 
Основные положения иммунодиагностики просмотров - 400
Основные положения иммунодиагностики. Материал для исследования иммунного статуса. Правила проведения иммунологического обследования. Общепринятые методы оценки состояния иммунитета. Особенности иммунологических показателей у детей.
Достижения иммунологии последних десятилетий привлекают внимание не только узких специалистов, но также и врачей почти всех специальностей: терапевтов, хирургов, гинекологов, педиатров, окулистов, дерматологов и других. Выявление аутоиммунного компонента широкого круга заболеваний и распространенность вторичных иммунодефицитных состояний способствовали разработке различных иммунологических тестов для диагностики заболевания, выбора метода лечения, прогнозирования тяжести течения и понимания патогенеза симптомов данного заболевания.
Сегодня лабораторные методы иммунодиагностики различных звеньев двух взаимосвязанных систем иммунитета – врожденной и адаптивной – применяются для оценки функционирования иммунной системы в норме и при заболеваниях человека. Эти методы составляют основу иммунодиагностики, целью которой являются, прежде всего:
· диагностика нарушений функций определенных звеньев иммунной системы, имеющих отношение к конкретному заболеванию у конкретного больного, а также
· выбор алгоритма индивидуальной иммунокоррекции и контроля ее эффективности.
Сегодня с диагностическими целями чаще всего используют стандартный набор лабораторных тестов для определения иммунного статуса больных, хотя не все показатели иммунного статуса в конечном итоге могут иметь отношение к иммунодиагностике. Так как иммунный статус неоднороден, крайне важно различать иммунный статус здорового организма и два его вида при патологии: антигенспецифический и антигеннеспецифический. Различают шесть вариантов антигенспецифического иммунного статуса: инфекционный, аллергический, аутоиммунный, онкологический, посттрансплантацонный, репродуктивный. Антигеннеспецифический формирует три варианта иммунного статуса: первичный и вторичный иммунодефицитные, лимфопролиферативный. Каждый вариант предусматривает оценку как общего, так и локального иммунного статуса. Такое деление важно, так как для каждого варианта иммунного статуса имеются свои, характерные иммунологические показатели.
Большинство методов оценки иммунного статуса имеют решающее значение лишь для выявления иммунодефицита͵ тогда как для диагностики других иммунопатологических состояний наиболее важно определение состояния антигенспецифической иммунологической реактивности: антител и эффекторных лимфоцитов. С учетом этого и в зависимости от конкретной крайне важности и производится оценка иммунного статуса больного, ᴛ.ᴇ. поиск основного дефекта в системе иммунитета. Так как такой дефект может локализоваться в различных звеньях врожденного и адаптивного иммунитета͵ то для оценки иммунного статуса, особенно иммунодефицитного, необходимы многие показатели, включая тесты первого и второго уровней. Вместе с тем, для иммунодиагностики бывают использованы и неиммунологические методы исследования (общеклинические, биохимические и др.).
Иммунологические методы диагностики основаны на иммунных реакциях, на определении клеточного состава, рецепторного репертуара и функций иммунокомпетентных клеток, а также на определении качественного и количественного состава важнейших молекул иммунной системы (цитокинов, растворимых форм рецепторов, медиаторов, белков и ингибиторов комплемента͵ гормонов тимуса и др.).
Хотя к настоящему времени разработано много стандартизованных методов иммунодиагностики, она все еще находится в периоде становления. Современные методы иммунодиагностики являются достаточно дорогостоящими и трудоемкими, а значит, к назначению этих методов нужно подходить грамотно и с большой ответственностью. Соответственно возникает крайне важность разработки определенных показаний для их назначения. Сегодня выделено три группы показаний:
· заболевания или состояния, при которых иммунологические методы исследования имеют решающее значение (СПИД, первичные иммунодефициты, трансплантация);
· заболевания, при которых методы оценки иммунного статуса способствуют текущему контролю за лечением (антибиотикотерапия, примененение цитостатиков и иммунодепрессантов, лучевая терапия и др.), оценке степени их тяжести, прогнозу осложнений и исходов заболеваний (инфекционнные заболевания с затяжным или хроническим течением, оперативные вмешательства);
· болезни, при которых специальные иммунологические методы помогают в дифференциальной диагностике заболеваний (аутоиммунные заболевания, лейкозы, лимфомы и др.).
Сегодня, как правило, применяется двухэтапный принцип оценки иммунного статуса человека. Его основные положения заложены в так называемой иммунограмме, отражающей, в основном, показатели тестов первого уровня, но, нередко, в зависимости от оснащенности лаборатории, и второго уровня.Иммунограмма представляет собойминимальный комплекс лабораторных показателей, достаточный для выявления иммунопатологического процесса в организме. При расшифровке конкретной иммунограммы показатели сравниваются с интервалом колебаний соответствующего показателя в норме. Эти интервалы определены в результате иммунологического исследования больших групп здоровых людей с использованием стандартизированных методов, приборов и реактивов.
В соответствии с двухэтапным принципом оценки иммунного статуса для иммунодиагностики используются лабораторно-диагностические тесты первого и второго уровней.
Первый – ориентировочный уровень включает простые, так называемые, ориентировочные тесты, позволяющие охарактеризовать функцию базовых компонентов иммунной системы организма, выявить «грубые» дефекты в различных звеньях врожденного и адаптивного иммунитета. Ктестам первого уровняотносятся:
· определение общего числа лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и тромбоцитов в периферической крови;
· определение относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток с использованием МКА против CD3, CD20, CD16/56-антигенов соответственно;
· определение количества субпопуляций Т-лимфоцитов: Т-хелперов (CD4+), ЦТЛ (CD3+CD8+) и их соотношения (CD4+/ CD8+);
· определение концентрации базовых сывороточных иммуноглобулинов (Ig M, IgG, IgA);
· определение фагоцитарной активности лейкоцитов, НСТ-тест;
· определение уровня ЦИК в сыворотке и крови;
· тест торможения миграции лейкоцитов;
· другие показатели.
При наличии специальных показаний и отклонений в ориентирующих тестах на втором этапе проводится более тщательный анализ состояния отдельных звеньев иммунитета человека, позволяющий уточнить характер локализации дефекта͵ выявленного на предыдущем этапе, и решить вопрос о целесообразности применения иммунокоррекции.
Набор тестов второго уровня включает тесты, характеризующие состояние иммунной системы как in vivo (оценка эффективности иммунизации; результаты кожных проб), так и in vitro, и может быть различным в зависимости от поставленных задач.
К примеру, для оценки аутоиммунного статуса дополнительно проводят определение уровней специфических аутоантител; для оценки аллергического статуса – проведение кожных проб и т.д. С помощью аналитических тестов второго уровня определяют:
· количество субпопуляций лимфоцитов: Тх1, Тх2, Тх17, естественные и индуцированные регуляторные Т-клетки, NKT-лимфоциты и др;
· пролиферативный ответ на Т- и В-митогены (реакция бласттрансформа-
ции лимфоцитов);
· цитотоксическую активность киллерных лимфоцитов (CD8+ЦТЛ, NK-клеток и др.);
· функциональную активность Тх1, Тх2, Тх17, естественных регуляторных Т-клеток по внутриклеточному содержанию и продукции типичных цитокинов (IFN-γ, ИЛ-4, ИЛ-17, TGF-β соответственно);
· содержание наиболее типичных цитокинов в сыворотке и биологических жидкостях;
· экспрессию рецепторов цитокинов (CD25 – рецептор к ИЛ-2);
· экспрессию активационных маркеров: CD69, CD71, HLA-DR и др.;
· классы и подклассы сывороточных, секреторных и других иммуноглобулинов;
· антитела разной специфичности, в том числе аутоантитела, патологические иммуноглобулины;
· оценка фагоцитарного звена;
· экспрессию на лейкоцитах молекул адгезии;
· содержание различных компонентов комплемента;
· другие показатели.
Для оценки состояния врожденной фагоцитарной системычаще всего используется определение:
· фагоцитарного индекса нейтрофилов и моноцитов;
· бактерицидности нейтрофилов и моноцитов;
· образования активных форм кислорода и азота;
· хемотаксиса;
· экспрессии на лейкоцитах молекул адгезии.
Для оценки состояния адаптивногогуморального иммунитета используют определение:
· базовых классов и подклассов иммуноглобулинов IgA (1,2), Ig M, IgG (G1-4) и IgE в сыворотке крови, а также в секретах слизистых;
· общей гемолитической активности комплемента;
· концентрации циркулирующих иммунных комплексов.
Для определения клеточного состава лимфоидной популяции используется иммунофенотипирование лимфоцитов с помощью моноклональных антител, позволяющее определять процентное содержание лимфоцитов и их субпопуляций, а также наличие на них рецепторов к некоторым цитокинам, к примеру:
· CD2+(CD3+), CD4+, CD8+ – Т-лимфоциты и их субпопуляции;
· CD20+ (19+, 21+, 22+, 72+) – В-лимфоциты;
· CD16+CD56+ – NK-клетки;
· CD25+ - рецептор для ИЛ-2.
Для определения функциональной активности лимфоцитов используются, к примеру, следующие тесты:
· оценка цитотоксической активности NK - клеток;
· исследование пролиферативного ответа на Т- и В-митогены (реакция бласттрансформации лимфоцитов).
Для определения цитокинового статуса используются тесты:
· определение количества цитокинов в биологических жидкостях;
· определение спонтанного и индуцированного синтеза цитокинов мононуклеарами периферической крови in vitro;
· определение внутриклеточного содержания цитокинов, в частности, IFN-g и IL-4 как маркеров Th1 и Th2-лимфоцитов.
Еще в 1990 году Л.В.Ковальчуком и А.Н.Чередеевым был предложен патогенетический принцип оценки функциональной активности иммунной системы, который основан на выявлении уровня патогенетического дефекта в результате лабораторных исследований ключевых этапов иммунного ответа: распознавания, активации, пролиферации, дифференцировки, эффекторной фазы иммунного ответа и регуляции на всех этапах иммунного ответа. Один из важнейших постулатов этой концепции: при блоке предыдущего этапа последующий несостоятелен, и нужно искать подходы для снятия данного блока. Примерный современный набор тестов, который целесообразно применять с этой целью, приведен в табл 22.
Таблица 22. Примерные тесты для оценки ключевых этапов иммунного ответа
| Стадии развития иммунного ответа | Примеры тестов, применяемых для оценки соответствующей стадии иммунного ответа |
| Распознавание | СКЛ, определение экспрессии молекул HLA II класса |
| Активация | Определение на клетках маркеров активации CD25, CD69, CD71, HLA-DR и др., определение уровня провоспалительных цитокинов, определение внутри-клеточных сигнальных молекул |
| Пролиферация | РБТЛ с митогенами, РБТЛ на специфические анти-гены и аллергены |
| Эффекторная стадия | Исследование клеточной цитотоксичности (CD8+ЦТЛ, NK-клеток и др.); определение концентрации сывороточных и секреторных иммуноглобулинов |
| Регуляция иммунного ответа | CD4+/CD8+, соотношение про- и противовоспали-тельных цитокинов в сыворотке и различных биоло-гических жидкостях, определение количества CD4+CD25+FохР3+-клеток |
Материал для исследования иммунного статуса
Современная практика клинико-иммунологических исследований среди различных биологических жидкостей выделила основным объектом анализа кровь – ее клеточные компоненты и сыворотку. Для иммунологических исследований используют клетки врожденного и адаптивного иммунитета – лейкоциты, к которым относятся гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Наибольший интерес с точки зрения иммунологов представляют лимфоциты – высокоспециализированные клетки адаптивной иммунной системы. Выделение мононуклеарной фракции крови, в том числе лимфоцитов, производят по методу Boyum (1968), основанному на различии плотности форменных элементов крови.
Для исследования сыворотки кровь берется обычно из локтевой вены, в пробирке она быстро свертывается и разделяется на сгусток с попавшими клетками крови и прозрачную сыворотку крови, которую можно использовать для определения растворимых компонентов врожденного и адаптивного иммунитета.
При крайне важности получения клеточных компонентов крови для иммунологических исследований в пробирку для забора крови предварительно добавляют гепарин – антикоагулянт, который препятствует свертыванию крови и обеспечивает сохранение форменных элементов крови в виде суспензии в плазме. Затем кровь разводят физиологическим раствором и наслаивают ее в пробирку, наполовину заполненную фиколл-изопаком или фиколл-верографином, и затем центрифугируют. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографина создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании суспензии разделить клетки периферической крови на фракции с большей и меньшей, чем градиент, плотностью. В градиенте плотности фиколл-изопака или фиколл-верографина (d=1,077г/см3) на границе раздела фаз образуется кольцо, содержащее слой мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты). Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки (рис.51). Это объясняется тем, что плотность фиколл-верографина выше, чем плотность лимфоцитов, но ниже, чем плотность эритроцитов и гранулоцитов.
Материалы для исследования показателей иммунной системы бывают различными в зависимости от клинической картины заболевания и от
Рисунок 51. Выделение лимфоцитов в градиенте плотности