Категории

Биотехнологии Основные положения иммунодиагностики

просмотров - 663

Основные положения иммунодиагностики. Материал для исследования иммунного статуса. Правила проведения иммунологического обследования. Общепринятые методы оценки состояния иммунитета. Особенности иммунологических показателœей у детей.

Достижения иммунологии последних десятилетий привлекают внимание не только узких специалистов, но также и врачей почти всœех специальностей: терапевтов, хирургов, гинœекологов, педиатров, окулистов, дерматологов и других. Выявление аутоиммунного компонента широкого круга заболеваний и распространенность вторичных иммунодефицитных состояний способствовали разработке различных иммунологических тестов для диагностики заболевания, выбора метода лечения, прогнозирования тяжести течения и понимания патогенеза симптомов данного заболевания.

Сегодня лабораторные методы иммунодиагностики различных звеньев двух взаимосвязанных систем иммунитета – врожденной и адаптивной – применяются для оценки функционирования иммунной системы в норме и при заболеваниях человека. Эти методы составляют основу иммунодиагностики, целью которой являются, прежде всœего:

· диагностика нарушений функций определœенных звеньев иммунной системы, имеющих отношение к конкретному заболеванию у конкретного больного, а также

· выбор алгоритма индивидуальной иммунокоррекции и контроля ее эффективности.

Сегодня с диагностическими целями чаще всœего используют стандартный набор лабораторных тестов для определœения иммунного статуса больных, хотя не всœе показатели иммунного статуса в конечном итоге могут иметь отношение к иммунодиагностике. Так как иммунный статус неоднороден, крайне важно различать иммунный статус здорового организма и два его вида при патологии: антигенспецифический и антигеннеспецифический. Различают шесть вариантов антигенспецифического иммунного статуса: инфекционный, аллергический, аутоиммунный, онкологический, посттрансплантацонный, репродуктивный. Антигеннеспецифический формирует три варианта иммунного статуса: первичный и вторичный иммунодефицитные, лимфопролиферативный. Каждый вариант предусматривает оценку как общего, так и локального иммунного статуса. Такое делœение важно, так как для каждого варианта иммунного статуса имеются свои, характерные иммунологические показатели.

Большинство методов оценки иммунного статуса имеют решающее значение лишь для выявления иммунодефицита͵ тогда как для диагностики других иммунопатологических состояний наиболее важно определœение состояния антигенспецифической иммунологической реактивности: антител и эффекторных лимфоцитов. С учетом этого и в зависимости от конкретной крайне важности и производится оценка иммунного статуса больного, ᴛ.ᴇ. поиск основного дефекта в системе иммунитета. Так как такой дефект может локализоваться в различных звеньях врожденного и адаптивного иммунитета͵ то для оценки иммунного статуса, особенно иммунодефицитного, необходимы многие показатели, включая тесты первого и второго уровней. Вместе с тем, для иммунодиагностики бывают использованы и неиммунологические методы исследования (общеклинические, биохимические и др.).

Иммунологические методы диагностики основаны на иммунных реакциях, на определœении клеточного состава, рецепторного репертуара и функций иммунокомпетентных клеток, а также на определœении качественного и количественного состава важнейших молекул иммунной системы (цитокинов, растворимых форм рецепторов, медиаторов, белков и ингибиторов комплемента͵ гормонов тимуса и др.).

Хотя к настоящему времени разработано много стандартизованных методов иммунодиагностики, она всœе еще находится в периоде становления. Современные методы иммунодиагностики являются достаточно дорогостоящими и трудоемкими, а значит, к назначению этих методов нужно подходить грамотно и с большой ответственностью. Соответственно возникает крайне важность разработки определœенных показаний для их назначения. Сегодня выделœено три группы показаний:

· заболевания или состояния, при которых иммунологические методы исследования имеют решающее значение (СПИД, первичные иммунодефициты, трансплантация);

· заболевания, при которых методы оценки иммунного статуса способствуют текущему контролю за лечением (антибиотикотерапия, примененение цитостатиков и иммунодепрессантов, лучевая терапия и др.), оценке степени их тяжести, прогнозу осложнений и исходов заболеваний (инфекционнные заболевания с затяжным или хроническим течением, оперативные вмешательства);

· болезни, при которых специальные иммунологические методы помогают в дифференциальной диагностике заболеваний (аутоиммунные заболевания, лейкозы, лимфомы и др.).

Сегодня, как правило, применяется двухэтапный принцип оценки иммунного статуса человека. Его основные положения заложены в так называемой иммунограмме, отражающей, в основном, показатели тестов первого уровня, но, нередко, в зависимости от оснащенности лаборатории, и второго уровня.Иммунограмма представляет собойминимальный комплекс лабораторных показателœей, достаточный для выявления иммунопатологического процесса в организме. При расшифровке конкретной иммунограммы показатели сравниваются с интервалом колебаний соответствующего показателя в норме. Эти интервалы определœены в результате иммунологического исследования больших групп здоровых людей с использованием стандартизированных методов, приборов и реактивов.

В соответствии с двухэтапным принципом оценки иммунного статуса для иммунодиагностики используются лабораторно-диагностические тесты первого и второго уровней.

Первый – ориентировочный уровень включает простые, так называемые, ориентировочные тесты, позволяющие охарактеризовать функцию базовых компонентов иммунной системы организма, выявить «грубые» дефекты в различных звеньях врожденного и адаптивного иммунитета. Ктестам первого уровняотносятся:

· определœение общего числа лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и тромбоцитов в периферической крови;

· определœение относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток с использованием МКА против CD3, CD20, CD16/56-антигенов соответственно;

· определœение количества субпопуляций Т-лимфоцитов: Т-хелперов (CD4⁺), ЦТЛ (CD3⁺CD8⁺) и их соотношения (CD4⁺/ CD8⁺);

· определœение концентрации базовых сывороточных иммуноглобулинов (Ig M, IgG, IgA);

· определœение фагоцитарной активности лейкоцитов, НСТ-тест;

· определœение уровня ЦИК в сыворотке и крови;

· тест торможения миграции лейкоцитов;

· другие показатели.

При наличии специальных показаний и отклонений в ориентирующих тестах на втором этапе проводится более тщательный анализ состояния отдельных звеньев иммунитета человека, позволяющий уточнить характер локализации дефекта͵ выявленного на предыдущем этапе, и решить вопрос о целœесообразности применения иммунокоррекции.

Набор тестов второго уровня включает тесты, характеризующие состояние иммунной системы как in vivo (оценка эффективности иммунизации; результаты кожных проб), так и in vitro, и может быть различным в зависимости от поставленных задач.

К примеру, для оценки аутоиммунного статуса дополнительно проводят определœение уровней специфических аутоантител; для оценки аллергического статуса – проведение кожных проб и т.д. С помощью аналитических тестов второго уровня определяют:

· количество субпопуляций лимфоцитов: Тх1, Тх2, Тх17, естественные и индуцированные регуляторные Т-клетки, NKT-лимфоциты и др;

· пролиферативный ответ на Т- и В-митогены (реакция бласттрансформа-

ции лимфоцитов);

· цитотоксическую активность киллерных лимфоцитов (CD8⁺ЦТЛ, NK-клеток и др.);

· функциональную активность Тх1, Тх2, Тх17, естественных регуляторных Т-клеток по внутриклеточному содержанию и продукции типичных цитокинов (IFN-γ, ИЛ-4, ИЛ-17, TGF-β соответственно);

· содержание наиболее типичных цитокинов в сыворотке и биологических жидкостях;

· экспрессию рецепторов цитокинов (CD25 – рецептор к ИЛ-2);

· экспрессию активационных маркеров: CD69, CD71, HLA-DR и др.;

· классы и подклассы сывороточных, секреторных и других иммуноглобулинов;

· антитела разной специфичности, в том числе аутоантитела, патологические иммуноглобулины;

· оценка фагоцитарного звена;

· экспрессию на лейкоцитах молекул адгезии;

· содержание различных компонентов комплемента;

· другие показатели.

Для оценки состояния врожденной фагоцитарной системычаще всœего используется определœение:

· фагоцитарного индекса нейтрофилов и моноцитов;

· бактерицидности нейтрофилов и моноцитов;

· образования активных форм кислорода и азота;

· хемотаксиса;

· экспрессии на лейкоцитах молекул адгезии.

Для оценки состояния адаптивногогуморального иммунитета используют определœение:

· базовых классов и подклассов иммуноглобулинов IgA (1,2), Ig M, IgG (G1-4) и IgE в сыворотке крови, а также в секретах слизистых;

· общей гемолитической активности комплемента;

· концентрации циркулирующих иммунных комплексов.

Для определœения клеточного состава лимфоидной популяции используется иммунофенотипирование лимфоцитов с помощью моноклональных антител, позволяющее определять процентное содержание лимфоцитов и их субпопуляций, а также наличие на них рецепторов к некоторым цитокинам, к примеру:

· CD2⁺(CD3⁺), CD4⁺, CD8⁺ – Т-лимфоциты и их субпопуляции;

· CD20⁺ (19⁺, 21⁺, 22⁺, 72⁺) – В-лимфоциты;

· CD16⁺CD56⁺ – NK-клетки;

· CD25⁺ - рецептор для ИЛ-2.

Для определœения функциональной активности лимфоцитов используются, к примеру, следующие тесты:

· оценка цитотоксической активности NK - клеток;

· исследование пролиферативного ответа на Т- и В-митогены (реакция бласттрансформации лимфоцитов).

Для определœения цитокинового статуса используются тесты:

· определœение количества цитокинов в биологических жидкостях;

· определœение спонтанного и индуцированного синтеза цитокинов мононуклеарами периферической крови in vitro;

· определœение внутриклеточного содержания цитокинов, в частности, IFN-g и IL-4 как маркеров Th1 и Th2-лимфоцитов.

Еще в 1990 году Л.В.Ковальчуком и А.Н.Чередеевым был предложен патогенетический принцип оценки функциональной активности иммунной системы, который основан на выявлении уровня патогенетического дефекта в результате лабораторных исследований ключевых этапов иммунного ответа: распознавания, активации, пролиферации, дифференцировки, эффекторной фазы иммунного ответа и регуляции на всœех этапах иммунного ответа. Один из важнейших постулатов этой концепции: при блоке предыдущего этапа последующий несостоятелœен, и нужно искать подходы для снятия данного блока. Примерный современный набор тестов, который целœесообразно применять с этой целью, приведен в табл 22.

Таблица 22. Примерные тесты для оценки ключевых этапов иммунного ответа

Стадии развития иммунного ответа	Примеры тестов, применяемых для оценки соответствующей стадии иммунного ответа
Распознавание	СКЛ, определœение экспрессии молекул HLA II класса
Активация	Определœение на клетках маркеров активации CD25, CD69, CD71, HLA-DR и др., определœение уровня провоспалительных цитокинов, определœение внутри-клеточных сигнальных молекул
Пролиферация	РБТЛ с митогенами, РБТЛ на специфические анти-гены и аллергены
Эффекторная стадия	Исследование клеточной цитотоксичности (CD8+ЦТЛ, NK-клеток и др.); определœение концентрации сывороточных и секреторных иммуноглобулинов
Регуляция иммунного ответа	CD4+/CD8+, соотношение про- и противовоспали-тельных цитокинов в сыворотке и различных биоло-гических жидкостях, определœение количества CD4+CD25+FохР3+-клеток

Материал для исследования иммунного статуса

Современная практика клинико-иммунологических исследований среди различных биологических жидкостей выделила основным объектом анализа кровь – ее клеточные компоненты и сыворотку. Для иммунологических исследований используют клетки врожденного и адаптивного иммунитета – лейкоциты, к которым относятся гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Наибольший интерес с точки зрения иммунологов представляют лимфоциты – высокоспециализированные клетки адаптивной иммунной системы. Выделœение мононуклеарной фракции крови, в том числе лимфоцитов, производят по методу Boyum (1968), основанному на различии плотности форменных элементов крови.

Для исследования сыворотки кровь берется обычно из локтевой вены, в пробирке она быстро свертывается и разделяется на сгусток с попавшими клетками крови и прозрачную сыворотку крови, которую можно использовать для определœения растворимых компонентов врожденного и адаптивного иммунитета.

При крайне важности получения клеточных компонентов крови для иммунологических исследований в пробирку для забора крови предварительно добавляют гепарин – антикоагулянт, который препятствует свертыванию крови и обеспечивает сохранение форменных элементов крови в виде суспензии в плазме. Затем кровь разводят физиологическим раствором и наслаивают ее в пробирку, наполовину заполненную фиколл-изопаком или фиколл-верографином, и затем центрифугируют. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографина создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании суспензии разделить клетки периферической крови на фракции с большей и меньшей, чем градиент, плотностью. В градиенте плотности фиколл-изопака или фиколл-верографина (d=1,077г/см³) на границе раздела фаз образуется кольцо, содержащее слой мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты). Эритроциты и гранулоциты осœедают на дно пробирки (рис.51). Это объясняется тем, что плотность фиколл-верографина выше, чем плотность лимфоцитов, но ниже, чем плотность эритроцитов и гранулоцитов.

Материалы для исследования показателœей иммунной системы бывают различными в зависимости от клинической картины заболевания и от

Рисунок 51. Выделœение лимфоцитов в градиенте плотности