Open Library - открытая библиотека учебной информации

Открытая библиотека для школьников и студентов. Лекции, конспекты и учебные материалы по всем научным направлениям.

Категории

Биотехнологии Проба Праустница-Кюстнера
просмотров - 153

Кожно-аллергические пробы

Диагностика аллергических заболеваний

Для диагностики аллергических заболеваний используют следующие лабораторные методы.

Проводят внутрикожные пробы с подозреваемыми аллергенами с учетом реакции через 15-30 минут.

Здоровому добровольцу внутрикожно вводят сыворотку больного. Через 12-24 часа в это же место вводят подозреваемый аллерген. Реакцию учитывают через 15-30 минут. IgE, содержащийся в сыворотке больного, прикрепляется к Fc-рецептором тучных клеток кожи добровольца. При введении сюда же аллергена последний связывается с Fab-фрагментами IgE, что приводит к дегрануляции тучных клеток и возникновению воспалительной реакции.

Иммунофлуоресцентный анализ используют для оценки уровня общего IgE и определœения уровня специфического IgE.

Принцип метода. Исследуемый аллерген связывается с твердой фазой (бумажный диск, активированный полимер и др.) При добавлении сыворотки больного происходит связывание аллергена, фиксированного на твердой фазе, с антителом, если в сыворотке присутствуют соответствующие данному аллергену антитела. После отмывания несвязавшихся IgE добавляют антитела против IgE, меченные флуорохромом. Происходит образование комплекса: аллерген, IgE и антитела против IgE. Несвязавшиеся антитела удаляются. Уровень связавщегося специфического IgE определяется по интенсивности свечения.

Метод Шелли (прямой и непрямой) используют для определœения аллергенспецифического IgE, фиксированного на тучных клетках и базофилах и вызывающего их дегрануляцию.

Принцип непрямого метода основан на изучении морфологических изменений тучных клеток и базофилов лабораторных животных в результате взаимодействия с сывороткой больного и специфическим аллергеном. IgE, содержащийся в сыворотке, фиксируется на Fc-рецепторах тучных клеток и базофилов. Затем добавляемый аллерген связывается с Fab-фрагментами молекул IgE, фиксированных на клетках, что вызывает их дегрануляцию. Краситель нейтральный красный избирательно окрашивает гранулы базофилов в кирпично-красный цвет, что позволяет их отличать от других клеток. Реакцию наблюдают под микроскопом с иммерсионной системой. Неизмененные базофилы имеют округлую форму, гранулы, окрашенные краской, располагаются внутри клетки. Положительная реакция проявляется в деформации клеток, образовании псевдоподий, усиленном движении гранул и в редких случаях – выходом гранул из клетки с разрывом ее. В каждом препарате насчитывают 40 базофилов, вычисляют процент морфологически измененных клеток в опыте и в контроле.

Прямой тест основан на изучении морфологических изменений базофилов периферической крови пациента с аллергическими заболеваниями при взаимодействии со специфическим аллергеном. Оценивается реакция аналогично оценке при непрямом тесте.

Большой популярностью пользуется определœение показателя повреждения нейтрофилов –тест ППН по В.А. Фрадкину (1985). ППН используется при десятках различных заболеваний: многих инфекционных, аутоиммунных, аллергических как I, так и II и III типов.

Данный тест выявляет циркулирующие или фиксированные на нейтрофилах антитела или иммунные комплексы: благодаря наличию на нейтрофилах рецепторов для Fc-фрагмента IgG и для С3 при соединœении антигена с антителом и фиксации комплемента происходит активизация нейтрофилов, осуществляющих фагоцитоз иммунных комплексов. В соответствии с этим наиболее высокие показатели ППН отмечены при III типе гиперчувствительности - иммунокомплексном.

Принцип проведения теста ППН. В разные лунки вносят определœенный объем готовых заводских аллергенов (в разведении 1:100), одна лунка служит контролем (физиологический раствор). Лейкоциты лейкоконцентратов обследуемого пациента нагружают различными аллергенами. Плашку с лунками помещают в термостат. После инкубации в каждую лунку добавляют по 1 капле 0,1% раствора акридинового оранжевого. Содержимое каждой лунки переносят на обезжиренные предметные стекла, последовательно пронумеровав их. Покрыв покровным стеклом, в герметичной влажной камере помещают приготовленные микропрепараты в холодильник на 16-18 часов. Подсчет клеток ведется методом непрямой иммунофлуоресценции в темном поле: подсчитываются количество поврежденных нейтрофилов, что выражается в процентном соотношении к количеству неизмененных клеток. В том случае, когда степень повреждения клеток в контроле (ᴛ.ᴇ. с физ. р-ром) высокая (от 16 % и выше), имеет место неспецифическая нестабильность мембран нейтрофилов, что, несомненно, повлияет на тактику лечения. Интерпретацию анализа, как правило, ведут врачи- аллергологи.