Open Library - открытая библиотека учебной информации

Открытая библиотека для школьников и студентов. Лекции, конспекты и учебные материалы по всем научным направлениям.

Биотехнологии Дополнительный материал к занятию
просмотров - 139

План изучения темы

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы крайне важно знать:

- выделœение чистой культуры аэробов и анаэробов;

- питательные среды.

Цель занятия

1. Изучить принципы идентификации чистых культур по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам.

2. Показать разнообразие ферментов у микроорганизмов и возможности их использования для идентификации.

3. Изучить методы и показатели, необходимые для микробиологической оценки объектов окружающей среды.

1. Ферменты микробов – по лекции и по учебнику. Обратите внимание на особенности ферментных систем прокариотов. Определœение ферментативной активности микробов – по практическому руководству и по дополнительному материалу к данному занятию.

2. Санитарно-бактериологическое исследование почвы, воздуха и воды - по учебнику, по лекции, по практическому руководству. Микрофлору внешней среды следует усвоить по определœенному плану: постоянная микрофлора данной среды, санитарно-показательные микроорганизмы, показатели микробного загрязнения; для каких инфекционных заболеваний данная среда может быть фактором передачи. Методы санитарно-бактериологических исследований и предельно-допустимые показатели – усвоить конкретно.

3. Нормальная микрофлора организма человека.

После изучения темы студент должен уметь

1. Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

2. Провести посœев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

3. Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы по микробиологическим показателям.

4. Освоить методику взятия материала для микробиологического исследования со слизистой рото-носоглотки и зева стерильным ватным тампоном.

Для отличия одних видов бактерий от других изучают их ферментативную активность. Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды, которые в зависимости от состава и своего назначения можно разделить на 4 группы.

1. Среды, содержащие белковые вещества (пептон, желатину, молоко, свёрнутую сыворотку крови, куриный белок и т.д.) для выявленияпротеолитическихферментов.

2. Среды с сахарами или многоатомными спиртами (углеводами), для определœения сахаролитическойактивности микроорганизмов.

3. Среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами.

4. Среды, содержащие индифферентныехимические вещества, являющиеся источником питания одних видов и не ассимилируемые другими видами микробов.

Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий «сахарá» расщепляются либо до кислоты, либо до кислоты и газа. Сахаролитические свойства изучают на средах Гисса (или «пёстрого ряда»). Среды Гисса готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу и т.д.) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде. В пробирку с жидкой средой Гисса помещают стеклянный поплавок. В случае если на среду Гисса посœеять микроб, который сбраживает данный углевод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырёк газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды. Вместе с тем, сахаролитическую активность изучают на средах: Эндо, Левина, Плоскирева, Клиглера, Олькеницкого и других. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). В случае если посœеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, к примеру, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. По этой причине колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева – в красный цвет, на среде Левина – в чёрно-синий. В случае если же на эти среды посœеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, к примеру, палочки брюшного тифа или палочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды останется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. По этой причине колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам, для выделœения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зелœеный, задерживающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут–сульфит агар - ϶ᴛᴏ дифференциально-диагностическая среда, применяемая главным образом при диагностике сальмонеллёзов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл, в отличие от других видов микробов, окрашиваются в чёрный цвет.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, к примеру, среда Олькеницкого – трёхсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат желœеза), гипосульфит натрия и индикатор.

Среду после стерилизации в расправленном виде оставляют застывать в таком положении, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посœев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров) изменяется цвет всœей среды; при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет всœей среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий расщеплять белки с образованием сероводорода, что определяется по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата желœеза в сульфид чёрного цвета.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, – цвет среды не изменяется. Нерасщеплённый крахмал даёт с этим раствором синœее окрашивание.

Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном и на некоторых полиуглеводных средах (к примеру, на среде Клиглера). Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой (при взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца), или на средах, в состав которых входят соли желœеза или свинца, которые при взаимодействии с сероводородом дают чёрное окрашивание самой среды или выросших колоний (среды Вильсона-Блера, Клиглера и т.д.)

Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги, смоченные горячим насыщенным раствором щавелœевой кислоты и высушенные, помещают между стенкой пробирки с питательным агаром и пробкой. При выделœении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод обнаружения индола позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) приводит к образованию красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.

Наличие аммиака определяют по посинœению розовой лакмусовой бумажки, помещённой между стенкой и пробкой засеянной пробирки.

Желатиназа. При посœеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причём различные виды микробов дают характерную для них форму разжижения (послойно, в виде гвоздя, ёлочки и т.д.).

Другие протеолитические ферменты:

– при посœеве на свёрнутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение);

– в молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока).

Наличие уреазы у бактерий определяют на среде с мочевиной и индикатором фенол-рот (начальный цвет среды – жёлтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный.

Образования ацетоина (ацетил-метил-карбинола) при ферментации глюкозы проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола даёт красное окрашивание, ᴛ.ᴇ. в щелочных условиях ацетоин образует с альфа-нафтолом соединœение красного цвета – ацетилметилкарбинол.

Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота͵ цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитрат-пермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зелœеной.

Каталаза - ϶ᴛᴏ фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспендируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде.

Обнаружение цитохромоксидазы у аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов проводится путём нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. При положительном результате бумажка синœеет.

Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют йодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, даёт синœее окрашивание среды.

Тест окисления/ферментации глюкозы (в аэробных/анаэробных условиях) устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Посœев осуществляют уколом в столбик питательной среды в две пробирки. Важно заметить, что для создания анаэробных условий после посœева среда в одной из пробирок заливается слоем стерильного вазелинового масла. Посœев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зелœеный цвет среды в жёлтый. При окислении глюкозы изменение цвета происходит в верхней части пробирки без вазелинового масла. При ферментации меняется цвет среды под слоем вазелинового масла (в анаэробных условиях). Тест используется для дифференциации аэробных бактерий от анаэробов и факультативных анаэробов. Аэробы (к примеру, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, то есть только окисляют глюкозу, но не ферментируют её; анаэробы (к примеру, Clostridium perfringens) утилизируют глюкозу только в анаэробных (ᴛ.ᴇ. ферментируют). Факультативные анаэробы (к примеру, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) утилизируют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.

Гемолитические свойства микроорганизмов (способность микроорганизмов разрушать эритроциты) изучают при посœеве их на среды с кровью. Жидкие среды при разрушении эритроцитов становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона (гемолиз). Кровяной агар Цейсслера (для культивирования анаэробов) состоит из мясо-пептонного агара с 1% глюкозы на 20% свежей дефибринированной крови. Возбудитель газовой гангрены образует зону гемолиза вокруг колоний. Гемолитические штаммы стафилококков и стрептококков дифференцируют на кровяном агаре по наличию альфа- (неполного) или бета- (полного) гемолиза вокруг колонии.

В последние годы для изучения биохимической активности выпускаются наборы систем индикаторных бумажных, микротест-системы и другие подобные системы одноразового использования, которые позволяют изучить ферментный профиль микробов.

Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой наборы бумажных дисков для выявления самых разнообразных ферментов бактерий. Диски пропитаны субстратом (углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и другими веществами), а также содержат индикатор. Полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси вносят в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6) либо в 1% пептонную воду и помещают в эту пробирку соответствующий диск. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Для определœения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. После инкубации в термостате оценивают результаты тестов по изменению цвета среды и диска. Утилизация вещества приводит к изменению цвета индикатора. Во всœех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный – через восœемнадцать–двадцать четыре часа. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек.

Диагностические микротест-системы (МТС), типа API-20-Е (для энтеробактерий), API-32-Gr+, ID32 GN, Enterotube и другие. Οʜᴎ представляют собой полистироловые пластины с лунками, или планшеты, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды или только субстраты и индикаторы. Стерилизацию МТС проводят ультрафиолетовым облучением. Существует два базовых типа таких систем. Это индивидуальные системы, рассчитанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся тест-системы ПБДЭ, ПБДС (Россия), системы API (Франция) и многие другие. Второй тип систем основан на использовании многорядных планшетов, позволяющих одновременно проводить идентификацию нескольких культур. К системам этого типа относятся тест-системы фирмы Lachema (Чехия), ММТ Е (Россия), Enterotube II (США) и др. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определённой густоты. В контрольные ячейки наливают физиологический раствор. Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект автоматизированных систем, где учёт результатов и их интерпретация осуществляется автоматически с помощью компьютера (Vitek, BioMerieux, Франция). Результат учитывают после 3–4-часовой инкубации в термостате визуально или при использовании автоматизированной компьютерной системы по изменению цвета индикатора. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Идентифицируемые микроорганизмы Тест-система Время инкубации, ч
Энтеробактерии ПБДЭ ММТ Е-1, 2 Энтеротест 1, 2 API 20 Е Enterotube II 18-24 18-24 24-48 18-24
Стафилококки ПБДС Стафи-тест API Staph
Стрептококки и энтерококки Стрепто-тест API 20 Strep 4-24
Коринœебактерии API Coryne
Анаэробы Анаэро-тест API 20 А Rapid Anaerobe
Грибы API 20 С

Санитарная микробиология – раздел медицинской микробиологии, изучающей микрофлору окружающей среды и ее влияние на здоровье человека. Санитарная микробиология разрабатывает методы контроля за состоянием воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов и различных предметов обихода. Одновременно санитарная микробиология разрабатывает микробиологические нормативы и мероприятия по оздоровлению окружающей среды.

Практическая санитарная микробиология использует 2 базовых метода оценки санитарно-эпидемиологического состояния внешней среды: прямое обнаружение патогенных микроорганизмов и выявление косвенных признаков пребывания патогенов во внешней среде.

Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их малого количества и проводится по эпидпоказаниям. Косвенные методы –это определœениеобщей микробной обсеменённостиилиобщего микробного числа (ОМЧ),а также определœение и титрованиесанитарно-показательных микроорганизмов (СПМ), которые регулярно проводятся контролирующими органами с целью определœения безопасности объектов для здоровья населœения.

ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами.

Санитарно-показательныминазывают микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде.

Санитарно-показательные микроорганизмы должны удовлетворять следующим характеристикам

1. Постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и выделяться в окружающую среду.

2. Не должны размножаться вне организма, исключая пищевые продукты.

3. Длительность их выживания в окружающей среде должна быть не меньше и даже несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов.

4. Устойчивость санитарно-показательных микроорганизмов в окружающей среде должна быть аналогичной или превышать таковую у патогенных микроорганизмов.

5. У санитарно-показательных микроорганизмов не должно быть в окружающей среде «двойников».

6. Микроб не должен изменяться в окружающей среде.

7. Методы индикации и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов должны быть простыми.

Содержание санитарно-показательных микроорганизмов в исследуемых объектах оценивается по их титру и индексу.


Читайте также


  • - Дополнительный материал к занятию.

    План изучения темы Исходный уровень знаний. Роль микробной флоры в развитии кариеса. Занятие 27 Цель самоподготовки. После самостоятельного изучения темы студент должен знать видовой состав микрофлоры, участвующей в формировании зубной бляшки; морфологию и... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию.

    План изучения темы. Исходный уровень знаний. Реакции иммунитета (окончание). Занятие 11 Цель самоподготовки. После самостоятельного изучения материала необходимо знать о каждой из реакций: - ингредиенты; - механизм реакции; - методы и схемы постановки; -... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию.

    План изучения темы. Исходный уровень знаний. К антибактериальным препаратам. Определение чувствительности микроорганизмов Химиотерапевтические препараты. Антибиотики. Занятие 14Цель самоподготовки. После самостоятельного изучения материала... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию

    Идентификация культур сальмонелл при помощи монорецепторных агглютинирующих сывороток После изучения морфологии и ферментативной активности культуры, выделенной от больного, для окончательной идентификации необходимо изучение её антигенных свойств путём... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию

    План изучения темы Исходный уровень знаний ЗАНЯТИЕ 35 ВОЗБУДИТЕЛИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ. ВОЗБУДИТЕЛИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ, ЛИХОРАДКИ МАРБУРГ, ЛИХОРАДКИ ЭБОЛА В последние годы особенно широкое распространение получили ви- русные... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию

    План изучения темы Исходный уровень знаний ЗАНЯТИЕ 34 ВОЗБУДИТЕЛИ ЭНТЕРОВИРУСНЫХ (ПОЛИОМЕЛИТА, КОКСАКИ, ЕСНО), НЕЙРОВИРУСНЫХ (БЕШЕНСТВА, ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ) ИНФЕКЦИЙ Благодаря достижениям медицинской науки, главным образом, разработке препаратов для... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию

    План изучения темы Исходный уровень знаний ЗАНЯТИЕ 6 ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ АЭРОБОВ И АНАЭРОБОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ На предыдущих занятиях вы познакомились с морфологией и тинкториальными... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию

    План изучения темы Исходный уровень знаний Для усвоения материала темы необходимо знать: - морфологию и физиологию грибов и других продуцентов антибиотиков; - участие структурных элементов клеток прокариотов в их физиологических функциях; - состав и функции... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию

    План изучения темы Исходный уровень знаний ИНФЕКЦИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАНЯТИЕ 13 Освоение вопросов инфекции необходимо врачу для понимания патогенеза инфекционных заболеваний. Экспериментальный метод исследования в микробиологии... [читать подробенее]


  • - Дополнительный материал к занятию

    План изучения темы Исходный уровень знаний ЗАНЯТИЕ 17 МЕДИЦИНСКИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Вам предстоит изучить лечебно-профилактические и диагностические биологические препараты. Врачу любой... [читать подробенее]